sanatçı bir ailenin çocuğu olmasının avantajını daha küçük yaşlarda yaşamıştır. Annesi Virginia Admiral, bir ressamdı, babası Robert da şair, ressam ve heykeltıraş. Doğup büydüğü semtte ağırlıklı olan İtalyan komşuları bu içe kapanık çocuğu 'Bobby Milk' diye çağırırlardı. Utangaç bir çocuk olduğu doğruydu; zamanının çoğunu kitaplar arasında geçiriyordu.

Broadway’de sahnelenen oyunlarla büyüyen De Niro, ilk deneyimini "Oz Büyücüsü" rolüyle yaşadı. İlk filmi ise 1963 yılında tamamlanmasına rağmen 1969 yılında gösterime giren "The Wedding Party" filmidir. Ardından "Hi, Mom!", "Bloody Mama", "Jennifer on My Mind", "Born to Win" ve "The Gang That Couldn’t Shoot Straight" gibi küçük bütçeli filmlerde oynadı.

1973 senesinde De Niro ve yönetmen Martin Scorsese birlikte filmler çevirmek üzere adım attılar. İlk filmleri "Mean Streets", sonraki yıllarda gelecek olan 8 filmin ilkiydi. Taxi Driver (1976) ve "New York" (1977) filmlerinde birlikte çalışan De Niro ve Scorsese artık ikili olarak anılır oldu. Ardından "Kızgın Boğa" (Raging Bull) (1980), "The King of Comedy" (1983), "Sıkı Dostlar" (Goodfellas) (1990), "Korku Burnu" (1991) ve "Casino" (1995) gibi filmlerde birlikte çalıştılar.