Don Knotts liseye başlamadan önce çeşitli kilise ve okul etkinliklerinde bir vantrilog ve komedyen olarak çalışmaya başladı. Üniversite döneminde komedyen olmak için New York'a gitti ancak istediği başarıyı elde edemeyince Batı Virginia Üniversitesi'ndeki eğitimine geri döndü. Birinci sınıftayken ABD Ordusu'na katılan Don, 2. Dünya Savaşı sırasında Pasifik Adalarında orduya bağlı "Stars and Gripes" şovunun bir parçası olarak komedyenlik yaptı. 1948'de mezun olduktan sonra, yeniden New York'a taşındı. Burada birçok televizyon ve radyo programında görev aldı. 1955'te Broadway'in hit komedisi "No Time For Sergeants"da yer aldı. Bu Andy Griffith'in ile ilk işbirliğiydi. 1960`da The Andy Griffith Show`a katıldı ve burada şerif yardımcısı rolünü üstlendi. Knotts, muhteşem başarılı olan dizide 5 yıl rol aldı ve bu süreçte de 3 Emmy Ödülü kazandı. 1965’de film kariyeri için diziden ayrıldı. Daha sonra dönemsel olarak aldığı rollerle 1966 ve 1967’de iki Emmy ödülü daha kazandı. 1964’de ilk defa "The Incredible Mr. Limpet" filminde başrolü üstlendi. Bununla beraber "The Ghost and Mr. Chicken", "The Reluctant Astronaut" ve "The Shakiest Gun in the West" gibi düşük bütçeli filmlerde de oynadı. Bu filmlerle geniş bir üne kavuştu. 24 Şubat 2006 tarihinde Los Angeles'ta akciğer kanserinden yaşam veda eden sanatçı, yaşamının son zamanlarına kadar sinema ve dizilerde yer almayı sürdürdü.