Josh Hartnett lisede iken sağ dizinden sakatlandığı için futbolu bırakmak zorunda kaldı. Oyunculuk kariyerine lisede tiyatro yaparak başladı. Daha sonra ise Elden Henson ile birlikte Roulette Entertainment adlı yapım şirketini kurdu. Önceleri küçük rollerde ve reklamlarda rol alan Hartnett, HalloweenH20:20 Years Later (1998) filmi ve gerçek bir hikâye olan "Kara Şahin Düştü" filmindeki "Matt Eversmann" karakteri ile ünlendi. 2004 yılından 2006 yılına kadar "Black Dahlia" filminin çekimleri sırasında tanıştığı Scarlett Johansson‘la ilişki yaşadı. 2007 yılında ise Rihanna ile birliktelik yaşadı. 2008 yılında "August" filminin, 2009 yılında ise "Nobody" adlı filmlerinin yapımcılığını üstlendi. 2014’te başlayan ünlü "Penny Dreadful" dizisinde "Ethan Chandler" karakterini canlandıran oyuncu, 2016 yılında çekimleri başlayan Hollywood-Türkiye ortak yapımı "The Ottoman Lieutenant" filmde "Jude" karakterini canlandırmıştır.